Trước thí nghiệm này có ba giả thiết nêu ra cách hoạt động của quá trình tái bản DNA.

Trong giả thiết bán bảo toàn, do Watson và Crick đề xuất, hai sợi đơn của một phân tử DNA tách rời trong quá trình tái bản. Mỗi sợi đơn khi ấy trở thành một khuôn mẫu cho tổng hợp lên sợi mới.[2]

Giả thiết bảo toàn đề xuất toàn bộ phân tử DNA hoạt động như là một khuôn mẫu cho tổng hợp lên toàn bộ sợi xoắn kép mới. Theo mô hình này, protein histone bám vào DNA, xoay quanh sợi xoắn kép và làm lộ ra base nucleotide (mà bình thường nằm ở bên trong) khỏi liên kết hiđrô.[3]

Giả thiết phân tán được lấy ví dụ bằng mô hình do Max Delbrück đề xuất, mà có mục đích giải quyết vấn đề tháo xoắn của hai sợi đơn trong sợi DNA kép bằng một cơ chế phá vỡ bộ khung xương DNA thành những đoạn ngắn chứa khoảng 10 nucleotide, tháo xoắn phân tử nhỏ này, rồi gắn những đoạn cũ vào đoạn mới được tổng hợp. Quá trình này có thể tổng hợp DNA theo những đoạn ngắn xen kẽ từ một sợi này sang sợi khác.[4]

Mỗi một trong ba mô hình trên đưa ra các dự đoán khác nhau về sự phân bố của những phân tử thành phần của sợi DNA gốc trong sợi mới hình thành. Trong mô hình bảo toàn, sau khi tái bản, một sợi được giữ nguyên toàn bộ từ phân tử "cũ", và phân tử kia là phân tử DNA mới hoàn toàn. Giả thiết bán bảo toàn dự đoán mỗi sợi xoắn kép sau tái bản sẽ chứa một sợi đơn mới và một sợi đơn cũ từ DNA gốc. Mô hình phân tán dự đoán mỗi sợi kép mới sẽ chứa hỗn hợp các đoạn DNA cũ và mới.[5]